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本产品是以天然的亲水性高分子琼脂糖为基材的多孔微球，粒径为30～150μm表面为NHS基团修饰的磁珠。能够与带有伯胺基团的蛋白和其他分子形成稳定的肽键，用于亲和纯化抗体、抗原和其他生物分子。与传统的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基团的磁珠无需事先采用EDC/NHS或戊二醛进行活化，只需简单地将含伯氨基的生物配体溶解在试剂盒自带的Coupling Buffer中，室温下将蛋白与NHS磁珠混合1~2h便可将生物配体共价偶联到磁珠上，具有操作简单、偶联条件温和、生物配体偶联快速高效等优点。磁珠偶联过程必需在不含任何氨基的缓冲溶剂中进行。人工操作时，使用磁性分离架实现磁珠与溶剂分离。也可采用自动化设备操作，自动化操作适合用于多样品的筛选。

• 简便，无需活化，可直接与生物配体共价偶联；
  
• 高效，生物配基偶联效率可达90%以上，大大高于羧基磁珠，同时配基的结合载量更高；
  
• 快速，1~2h便可完成生物配基偶联；
  
• 温和，室温或4℃偶联，偶联体系pH为5～9；
  
• 稳定，形成稳定的酰胺键，防止配基脱落。
  
• 良好的生物相容性，减少非特异性吸附。

磁珠基材：交联磁性琼脂糖微球
磁珠粒径：30～150μm
配基：N-羟基琥珀酰亚胺
配基密度：20～30μmol/mL磁珠
结合能力：20～30mg兔IgG/mL磁珠
磁珠悬液浓度：20% (v/v)磁珠悬液(1mL磁珠悬液中含有200μL磁珠)
保存液：无水异丙醇
保存：2～8℃，有效期一年。

• 磁珠对水分敏感。为了保证产品质量，在取样之后需立即盖上瓶盖，并用封口膜密封，于4℃保存。
  
• 禁止将磁珠干燥或冷冻。干燥和冷冻操作可能导致磁珠的聚集从而丧失结合活性。
  
• 可通过间接法测定反应前后蛋白含量，或通过直接法检测偶联到磁珠表面的蛋白含量，使用280nm附近的波长来测定蛋白含量是不可取的，因为NHS基团在280nm波长附近有很强的吸收，会严重干扰检测结果。蛋白稳定剂(如BSA，gelatin)会抑制抗体与磁珠的结合，因此在磁珠偶联抗体过程中，需要确保抗体保存体系中不存在含伯氨基的蛋白稳定剂。
  
• 缓冲液中含有带伯胺的物质会抑制蛋白质偶联到磁珠表面，去除伯胺物质可采用透析和脱盐的方法。
  
• NHS基团易水解，故在用Washing Buffer A洗涤时，一定要参照说明书进行。
  
• 蛋白溶液要预先配制好，Washing Buffer A洗涤完毕后，要立即加入蛋白溶液进行偶联反应。
  
• 蛋白质和磁珠的偶联效率因蛋白质种类和性质差异而不同。一般而言，蛋白质浓度为≥3.0mg/mL时利于蛋白质偶联；然而，对于不同的蛋白其浓度需要优化。

序号	试剂名称	备注
①	Washing Buffer A	1mM盐酸，使用前冷却到4℃。
②	Coupling Buffer A	100mM 2-吗啉乙磺酸MES，pH4.8(用于等电点小于7的生物分子的偶联)
③	Coupling Buffer B	200mM NaHCO3，pH8.3(用于等电点大于7的生物分子的偶联)
④	Blocking Buffer	3M乙醇胺，pH9.0
⑤	Storage Buffer	1×PBS，可根据需求添加0.1% proclin-300

蛋白偶联操作流程图及优化点

1.	蛋白溶液的配制
	↓
2.	磁珠的洗涤
	↓	{	优化点1：Coupling Buffer的种类。首先通过实验确定最合适的Coupling Buffer
3.	蛋白偶联
	↓		优化点2：确定合适的Coupling Buffer后，再通过实验优化蛋白溶液的浓度
4.	封闭
	↓
5.	磁珠保存

说明：

• 其中磁珠洗涤要严格按照说明书采用冷却的Washing Buffer A(①)快速洗涤，以防磁珠在洗涤过程中NHS基团水解；
  
• 蛋白偶联过程中，首先要通过实验确定合适的Coupling Buffer(主要包括Coupling Buffer A(②)、Coupling Buffer B(③)、50mM硼酸溶液，pH8.5、100mM磷酸缓冲液，100mM NaCl，pH7.4这四种)；
  
• 确定合适的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer为基础，确定合适的偶联蛋白浓度，因为蛋白浓度越高，偶联到磁珠上的蛋白的量会越大(这是由于NHS基团跟蛋白偶联和NHS基团本身水解是一对竞争反应)。当然此处要综合考虑使用性能和成本，有些客户偶联少量的蛋白便可满足使用需求，这时采用低浓度的蛋白便可，这样可以降低成本。
  
• 封闭这一步可以采用试剂盒中自带的3M乙醇胺，也可使用Tris缓冲液(100mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0)，封闭时间不得低于2h，如果化学封闭后背景仍然很高，还可以额外加一步BSA封闭。

以下操作过程以取磁珠样品500μL，采用1.5mL EP管为例介绍。用户可根据自身需求按比例调整。

• 蛋白溶液配制
  取适量待偶联蛋白用Coupling Buffer溶解，配成浓度为≥3.0mg/mL的蛋白溶液。已经保存于buffer中的蛋白，需要通过透析或者脱盐的方法彻底除去原有buffer里含伯胺基的物质，然后再用Coupling Buffer配成浓度为≥3.0mg/mL的蛋白溶液，将配制好的蛋白溶液于4℃保存备用。
  注：
  ① 为了达到更好的性能，蛋白浓度≥3.0mg/mL，这样偶联效率会更高，此处需综合考虑成本和使用要求；
  ② 蛋白溶液中不能含有带伯氨基的成分，比如Tris，甘氨酸，明胶，BSA等；
  
• 磁珠清洗
  
  • 取500μL 20%的磁珠悬浮液于1.5mL EP管中。
    注：磁珠取样前要反复颠倒、使用涡旋振荡器使其混合均匀，以保证实验的同一性，每取一次样需要重新混匀。
    
  • 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
    
  • 加1mL 2～8℃的Washing Buffer A(①)于离心管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀。
    
  • 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
• 蛋白质固定
  
  • 加200μL蛋白溶液于EP管中，涡旋30 s，使其混合均匀。
    注：磁珠洗涤后要立即加入蛋白溶液。
    
  • 将EP管涡旋15 s，置于垂直混合仪上，室温混合2~4h。如果垂直混合不均匀，则反应前30min，每隔5min取下EP管涡旋15 s。此后，每隔15min，取下EP管涡旋15 s。
    注：如有需要可以在4℃反应过夜。
    
  • 采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。
• 磁珠封闭
  
  • 加1mL Blocking Buffer(④)于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
    注：Blocking Buffer(④)除了试剂盒中提供的3M乙醇胺外，也可以使用100mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0等其它封端试剂。
    
  • 重复“步骤4.a.”四次。
    
  • 加1mL Blocking Buffer(④)于EP管中，涡旋30 s，将EP管置于垂直混合仪中室温反应2h。
    
  • 将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。
    
  • 加1mL超纯水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。
• 保存
  
  • 加1mL Storage Buffer(⑤)(比如含0.05%叠氮化钠的PBS缓冲液，或者客户根据自己实际需求选择合适的保存溶液)于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次。
    
  • 加入1mL Storage Buffer(⑤)于EP管中，充分混合，4℃保存备用。
    注：最终偶联蛋白的磁珠浓度为10% (v/v)。

相关搜索：NHS磁珠，BalBeads Magshow NHS(30-150μm)